
【實驗原理】
細胞劃痕法是簡捷測定細胞遷移運動與修復能力的方法,類似體外傷口愈合模型,在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細胞上,用微量槍頭或其他硬物在細胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線,去除中央部分的細胞,然后繼續(xù)培養(yǎng)細胞至實驗設定的時間,取出細胞培養(yǎng)板,觀察周邊細胞是否生長至中央劃痕區(qū),以此判斷細胞的生長遷移能力,實驗通常需設定正常對照組和實驗組,實驗組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等的組別,通過不同分組之間的細胞對于劃痕區(qū)的修復能力,可以判斷各組細胞的遷移與修復能力。
【應用簡介】
細胞遷移:也成為細胞移動、細胞爬行或細胞運動,是細胞在接受遷移信號或感受到某些物質的梯度后而產(chǎn)生的移動。
細胞遷移參與到很多生理和病理的活動中,如下:
1. 免疫:如淋巴細胞的定向遷移是其分化成熟和發(fā)揮功能的關鍵之一;
2. 炎癥:炎癥反映最重要的功能是將白細胞送到炎癥灶,白細胞遷移到炎癥部位并發(fā)揮其吞噬和組織損傷作用;
3. 腫瘤轉移:遷移是腫瘤細胞轉移過程中必不可少的環(huán)節(jié)之一。腫瘤細胞與母體瘤分離,穿越血管壁,侵襲周邊正常組織時,需要一定的運動能力。高轉移的腫瘤細胞通常具奮較強的運動性。多種物質可剌激腫瘤細胞的遷移,如腫瘤細胞分泌因子、生長因子、細胞外基質成分(FN、LN)以及一些癌轉移靶器官的代謝產(chǎn)物或分泌產(chǎn)物等生長因子對腫瘤細胞有趨化作用,可使其發(fā)生定向運動。測定方法以細胞劃痕法和Transwell小室法;
4. 損傷修復:當機體發(fā)生損傷時,免疫細胞和血小板會遷移到損傷部位,參與消炎和凝血;
5. 胚胎發(fā)育:胚胎期不同類型祖細胞遷移至特意靶位以保證各組織、器官的正常發(fā)育。
【實驗方法】
Culture Insert方法
1.準備細胞,培養(yǎng)液,culture Insert。
2.如圖,將細胞接種于Dish中間的Insert,細胞長滿Insert區(qū)域后用鑷子移除Insert即可產(chǎn)生500μm寬度的劃痕。
3.每隔4-6小時拍照記錄。
4.根據(jù)收集圖片數(shù)據(jù)分析實驗結果。
傳統(tǒng)實驗方法
1.培養(yǎng)板劃線
首先使用marker筆在6孔板背后,用直尺比著,均勻的劃橫線,大約每隔0.5~1cm一道,橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。劃線時注意線不要太粗 。
2.鋪細胞
在孔中加入約5×105個細胞(不同的細胞數(shù)量有所不同,根據(jù)細胞的生長快慢調整),接種原則為過夜后融合率達到100%。
3.細胞劃線
第二天用槍頭或者無菌牙簽,垂直與細胞平面,沿著投一天劃在平板背面的線在細胞層上進行劃痕(不同孔之間最好使用同一只槍頭或牙簽)。
4.洗細胞
劃痕完成后,使用無菌PBS洗細胞3次,洗去不貼壁的細胞,即劃線時劃線的細胞,是劃線后留下的間隙清晰可見,然后更換新鮮無血清培養(yǎng)基。
5.細胞培養(yǎng)、觀察
將細胞放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱,培養(yǎng)。然后在適當?shù)臅r間點,如0,6,12,24h取出細胞,顯微鏡線觀察并測量劃痕的寬度,并拍照(具體時間依實驗需要而定)。
【樣本送檢要求】
【案例展示】
【常見問題】
1.鋪細胞最好使用6孔板,因為6空板可以保證有相當距離的平直劃痕,而且因為有5條定位線,與劃痕相交,這樣就有10個可固定監(jiān)測點,不作重復,誤差也很小。當然若是需要高通量初篩時,也可以用12或24孔板。
2.如果你連續(xù)監(jiān)測24小時,你需要考慮到劃痕縮小是細胞遷移和細胞繁殖共同作用的結果,而不是單純的細胞遷移。如果你要單純的考慮細胞遷移,你可以先用絲裂霉素(1 μg/ml)處理一小時,抑制細胞的分裂,這樣你的結果就是細胞遷移的作用了。另外,使用無血清培養(yǎng)基也可以降低增殖對實驗結果的影響。
3.照片拍完之后,可以用image J來測量劃痕區(qū)域的像素定量比較細胞遷移的速度。
4.雖然無血清培養(yǎng)可以忽略細胞增殖的影響,但是由于細胞內(nèi)信號傳導系統(tǒng)整體性的下調節(jié),細胞遷移的速度也會慢很多。
5.在用PBS緩沖液沖洗時,注意貼壁慢慢加入,以免沖散單層貼壁細胞。
6.為了避免細胞數(shù)量和狀態(tài)受到影響,盡量不要用吸泵,可用移液槍緩慢吸走。
【服務流程】