【實驗原理】

細胞劃痕法是簡捷測定細胞遷移運動與修復能力的方法，類似體外傷口愈合模型，在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細胞上，用微量槍頭或其他硬物在細胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細胞至實驗設定的時間，取出細胞培養(yǎng)板，觀察周邊細胞是否生長至中央劃痕區(qū)，以此判斷細胞的生長遷移能力，實驗通常需設定正常對照組和實驗組，實驗組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等的組別，通過不同分組之間的細胞對于劃痕區(qū)的修復能力，可以判斷各組細胞的遷移與修復能力。

【應用簡介】

細胞遷移：也成為細胞移動、細胞爬行或細胞運動，是細胞在接受遷移信號或感受到某些物質的梯度后而產(chǎn)生的移動。

細胞遷移參與到很多生理和病理的活動中，如下：

1. 免疫：如淋巴細胞的定向遷移是其分化成熟和發(fā)揮功能的關鍵之一；

2. 炎癥：炎癥反映最重要的功能是將白細胞送到炎癥灶，白細胞遷移到炎癥部位并發(fā)揮其吞噬和組織損傷作用；

3. 腫瘤轉移：遷移是腫瘤細胞轉移過程中必不可少的環(huán)節(jié)之一。腫瘤細胞與母體瘤分離，穿越血管壁，侵襲周邊正常組織時，需要一定的運動能力。高轉移的腫瘤細胞通常具奮較強的運動性。多種物質可剌激腫瘤細胞的遷移，如腫瘤細胞分泌因子、生長因子、細胞外基質成分(FN、LN)以及一些癌轉移靶器官的代謝產(chǎn)物或分泌產(chǎn)物等生長因子對腫瘤細胞有趨化作用，可使其發(fā)生定向運動。測定方法以細胞劃痕法和Transwell小室法；

4. 損傷修復：當機體發(fā)生損傷時，免疫細胞和血小板會遷移到損傷部位，參與消炎和凝血；

5. 胚胎發(fā)育：胚胎期不同類型祖細胞遷移至特意靶位以保證各組織、器官的正常發(fā)育。

【實驗方法】

Culture Insert方法

1.準備細胞，培養(yǎng)液，culture Insert。

2.如圖，將細胞接種于Dish中間的Insert，細胞長滿Insert區(qū)域后用鑷子移除Insert即可產(chǎn)生500μm寬度的劃痕。

3.每隔4-6小時拍照記錄。

4.根據(jù)收集圖片數(shù)據(jù)分析實驗結果。

傳統(tǒng)實驗方法

1.培養(yǎng)板劃線
首先使用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻的劃橫線，大約每隔0.5~1cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。劃線時注意線不要太粗 。

2.鋪細胞
在孔中加入約5×105個細胞（不同的細胞數(shù)量有所不同，根據(jù)細胞的生長快慢調整），接種原則為過夜后融合率達到100%。

3.細胞劃線

第二天用槍頭或者無菌牙簽，垂直與細胞平面，沿著投一天劃在平板背面的線在細胞層上進行劃痕(不同孔之間最好使用同一只槍頭或牙簽)。

4.洗細胞
劃痕完成后，使用無菌PBS洗細胞3次，洗去不貼壁的細胞，即劃線時劃線的細胞，是劃線后留下的間隙清晰可見，然后更換新鮮無血清培養(yǎng)基。

5.細胞培養(yǎng)、觀察
將細胞放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。然后在適當?shù)臅r間點，如0，6，12，24h取出細胞，顯微鏡線觀察并測量劃痕的寬度，并拍照(具體時間依實驗需要而定)。

【樣本送檢要求】

【案例展示】

【常見問題】

1.鋪細胞最好使用6孔板，因為6空板可以保證有相當距離的平直劃痕，而且因為有5條定位線，與劃痕相交，這樣就有10個可固定監(jiān)測點，不作重復，誤差也很小。當然若是需要高通量初篩時，也可以用12或24孔板。

2.如果你連續(xù)監(jiān)測24小時，你需要考慮到劃痕縮小是細胞遷移和細胞繁殖共同作用的結果，而不是單純的細胞遷移。如果你要單純的考慮細胞遷移，你可以先用絲裂霉素（1 μg/ml）處理一小時，抑制細胞的分裂，這樣你的結果就是細胞遷移的作用了。另外，使用無血清培養(yǎng)基也可以降低增殖對實驗結果的影響。

3.照片拍完之后，可以用image J來測量劃痕區(qū)域的像素定量比較細胞遷移的速度。

4.雖然無血清培養(yǎng)可以忽略細胞增殖的影響，但是由于細胞內(nèi)信號傳導系統(tǒng)整體性的下調節(jié)，細胞遷移的速度也會慢很多。

5.在用PBS緩沖液沖洗時，注意貼壁慢慢加入，以免沖散單層貼壁細胞。

6.為了避免細胞數(shù)量和狀態(tài)受到影響，盡量不要用吸泵，可用移液槍緩慢吸走。

【服務流程】